2X Hot Start PCR Master Mix – NOVA BIOTECNOLOGIA

• Solução pronta-para-uso que contém Taq DNA Polimerase, anticorpo anti-Taq DNA polimerase, tampão de PCR, MgCl2, dNTPs e estabilizadores.
• 2X Hot Start PCR Master Mix é uma solução otimizada pronta para uso contendo Taq DNA Polimerase, anticorpo anti-Taq DNA polimerase, tampão de reação de PCR, MgCl2, dNTPs e estabilizadores. É ideal para aplicações de PCR de rotina a partir de modelos, incluindo soluções de DNA puro, colônias bacterianas e produtos de cDNA. Pode amplificar fragmentos de DNA até 5 kb.
• O anticorpo anti-Taq DNA polimerase inibe a atividade da polimerase, proporcionando um “hot start” automático e permite a configuração conveniente de reações de PCR à temperatura ambiente. Devido à ligação específica do anticorpo, o 2X Hot Start PCR Master Mix está presente em uma forma inativa e é reativado após uma etapa de desnaturação em ciclos de PCR a 95°C.
• O início da reação em temperatura elevada, mediada por anticorpos também pode melhorar a especificidade da PCR e o rendimento de fragmentos de DNA amplificados.

Aplicações:

• Primer extension.
• Análise de Microarrays.
• PCR de alto rendimento.

Lista de Componentes:

• Cada produto contém reagentes suficientes para realizar reações de PCR de 50 μL.

Protocolo:

• Este protocolo é para um tamanho de reação de 50 μL. O tamanho da reação pode ser ajustado conforme desejado.
• Para reação múltipla, prepare uma mistura principal dos componentes comuns a todas as reações para reduzir os erros de pipetagem.
• A) Descongele o PCR Master Mix à temperatura ambiente. Quando descongelado, ressuspender o Master Mix por vortex e, em seguida, centrifugar brevemente para coletar a solução no fundo do tubo.
• B) Prepare a seguinte mistura de reação para cada amostra.

Parâmetros de amplificação recomendados para PCR:

Modelo de DNA:

• O uso de modelos de DNA purificados de alta qualidade aumenta muito o sucesso da amplificação. As quantidades recomendadas de DNA template para uma reação de 50 μl são as seguintes: DNA genômico 1 de – 1 μg.
• Plasmídeo ou DNA viral 1 pg – 1 ng

Primers:

• Os iniciadores geralmente têm 20 entre 40 nucleotídeos de comprimento e idealmente têm um conteúdo de GC de 40 a 60%. Programas de computador como Primer3 podem ser usados para projetar ou analisar primers. A concentração final de cada primer em umareação pode ser 0,05–1μM, tipicamente 0,1– 0,5μM.

Mg++ e aditivos:

• A concentração de Mg++ de 1,5–2,0 mM é ideal para a maioria dos produtos de PCR gerados com Taq DNA Polimerase. A concentração final de Mg++ em 1X Hot Start PCR Master Mix é de 1,5 mM. Isso suporta amplificação satisfatória da maioria dos amplicons. No entanto, o Mg++ pode ser otimizado em incrementos de 0,5 ou 1,0 mM usando MgCl2.
• A amplificação de alguns alvos difíceis, como sequências ricas em GC, pode ser melhorada com aditivos,como DMSO, betaína ou Formamida.

Desnaturação:

• Uma desnaturação inicial de 30 segundos a 95°C é suficiente para a maioria dos moldes de DNA puro. Para template modelos difíceis, como sequências ricas em GC, uma desnaturação mais longa de 2 a 5 minutos a 95°C é recomendada antes do ciclo de PCR para desnaturar completamente o template. Com a PCR de colônia, recomenda-se uma desnaturação inicial de 5 minutos a 95°C.
• Uma etapa de desnaturação de 15 a 30 segundos a 95°C é recomendada durante os ciclos de PCR.

Anelamento:

• A etapa de Anelamento é tipicamente de 15 a 60 segundos. A temperatura de Anelamento é baseada na Tm do par de primers e normalmente é de 45 a 68°C. As temperaturas de Anelamento podem ser otimizadas fazendo uma PCR de gradiente de temperatura começando 5°C abaixo da Tm calculada.

Extensão:

• A reação de extensão é tipicamente realizada na temperatura ideal para a Taq DNA polimerase: 72°C. Permitir 1 minuto para cada 1kb de DNA a ser amplificado. Recomenda-se uma extensão final de 5 minutos a 72°C.

Número do ciclo:

• Geralmente, 25 a 35 ciclos produzem produto suficiente. Podem ser necessários até 45 ciclos para detectar alvos com baixo número de cópias.

Produto PCR:

• Os produtos de PCR gerados usando Taq DNA Polimerase contêm saliências da na extremidade 3’;portanto, os produtos de PCR podem ser ligados a vetores dT/dU-overhang.

Ensaios de Controle de Qualidade:

• 2X Hot Start PCR Master Mix é testado para desempenho na reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar uma região de 2 kb do gene beta-globina de 50 ng de DNA genômico humano. O produto de PCR resultante é visualizado em um gel de agarose corado com brometo de etídio

Parâmetros de amplificação para PCR do gene da beta-globina: