O espectrofotômetro é um dos instrumentos mais usados em laboratórios de química, bioquímica, biologia molecular e controle de qualidade. Ele mede quanto de luz uma amostra absorve e, com isso, permite determinar a concentração e a pureza de substâncias com rapidez e sem destruir a amostra. Neste guia, você entende o que é o equipamento, para que ele serve, como funciona, quais cubetas usar e como garantir leituras confiáveis.
O que é um espectrofotômetro
O espectrofotômetro é um instrumento que mede a intensidade da luz absorvida ou transmitida por uma amostra em comprimentos de onda específicos. Os modelos UV-VIS, os mais comuns em laboratório, trabalham do ultravioleta ao visível, geralmente entre 190 e 1100 nm.
O que é espectrofotometria
Espectrofotometria é a técnica analítica que o equipamento executa. Cada substância absorve luz de forma característica em determinados comprimentos de onda, e a quantidade de luz absorvida está diretamente ligada à concentração dessa substância na amostra.
Para que serve o espectrofotômetro: principais usos
- Quantificação de DNA e RNA: leitura a 260 nm. A relação A260/A280 indica a pureza da amostra, com valores próximos de 1,8 para DNA e de 2,0 para RNA.
- Dosagem de proteínas: leitura direta a 280 nm ou por métodos colorimétricos, como Bradford e BCA.
- Atividade enzimática: acompanhamento da variação de absorbância ao longo do tempo (cinética).
- Bioquímica clínica: dosagens como glicose, colesterol e proteínas totais por métodos colorimétricos.
- Controle de qualidade: análise de princípios ativos em fármacos, corantes em alimentos e pigmentos em cosméticos.
- Análise de água e ambiental: determinação de nitrato, fosfato, ferro e outros parâmetros.
- Pesquisa e ensino: desenvolvimento de métodos e aulas práticas de química analítica.
Como funciona o espectrofotômetro
O equipamento tem quatro componentes principais:
- Fonte de luz: uma lâmpada de deutério para o ultravioleta e uma de tungstênio-halogênio para o visível. Alguns modelos usam uma única lâmpada de xenônio.
- Monocromador: uma rede de difração separa a luz e seleciona o comprimento de onda da análise.
- Compartimento da amostra: onde fica a cubeta com a amostra (ou o pedestal, nos modelos de microvolume).
- Detector: mede a luz que atravessa a amostra e converte o sinal em absorbância.
A Lei de Beer-Lambert
O cálculo da concentração se baseia na Lei de Beer-Lambert: A = ε · b · c. A absorbância (A) é proporcional à absortividade molar da substância (ε), ao caminho óptico da cubeta (b, normalmente 1 cm) e à concentração (c). Com uma curva de calibração feita com padrões, o equipamento converte a absorbância medida em concentração.
Tipos de espectrofotômetro
Feixe único
Mede a referência (o branco) e a amostra em sequência. É o mais usado em rotinas de laboratório e no ensino. Exemplo: espectrofotômetro UV-VIS de feixe único 190 a 1100 nm.
Feixe duplo
Divide a luz em dois caminhos e mede amostra e referência ao mesmo tempo, compensando as variações da lâmpada e do sistema óptico. É indicado para análises de alta precisão e leituras longas. Exemplo: espectrofotômetro UV-VIS de feixe duplo touch screen.
Microvolume (nanodrop)
Lê volumes de cerca de 1 a 2 µL direto no pedestal, sem cubeta. É o padrão em biologia molecular para quantificar DNA, RNA e proteínas. Exemplo: espectrofotômetro nanodrop B-600. Saiba mais sobre o nanoespectrofotômetro.
Tipos de cubetas para espectrofotômetro
A escolha da cubeta depende da faixa de comprimento de onda da análise:
- Quartzo: transparente do ultravioleta ao infravermelho próximo (a partir de cerca de 190 nm). Obrigatória para leituras no UV, como DNA e proteínas.
- Vidro óptico: indicada para a faixa visível (a partir de cerca de 340 nm). Mais barata que o quartzo e reutilizável.
- Plástico de poliestireno: descartável, para a faixa visível (cerca de 340 a 800 nm). Prática para rotinas com muitas amostras.
- Plástico de acrílico (PMMA): descartável, cobre parte do UV próximo (a partir de cerca de 280 a 300 nm, conforme o fabricante).
- Microcubetas: para volumes reduzidos de amostra, mantendo o caminho óptico de 1 cm.
A maioria das cubetas tem caminho óptico de 10 mm. Sempre manuseie pelas faces foscas e posicione a face transparente no sentido do feixe de luz.
Precisão do espectrofotômetro: como garantir leituras confiáveis
- Ligue o equipamento antes do uso e aguarde a estabilização da lâmpada, conforme o manual.
- Faça a leitura do branco com o mesmo solvente ou reagente da amostra.
- Use cubetas limpas, sem riscos ou marcas de dedo, sempre na mesma posição.
- Trabalhe dentro da faixa linear da curva de calibração; amostras muito concentradas devem ser diluídas.
- Faça verificações periódicas de desempenho com padrões de referência (exatidão de comprimento de onda, exatidão fotométrica e luz espúria), conforme o sistema de qualidade do laboratório.
Espectrômetro vs espectrofotômetro
O espectrômetro é o instrumento que separa a luz e mede sua intensidade em cada comprimento de onda. O espectrofotômetro é um espectrômetro completo para análise de amostras: inclui a fonte de luz, o compartimento da amostra e o cálculo de transmitância e absorbância. Na prática de laboratório, para medir a concentração de substâncias em solução, o equipamento usado é o espectrofotômetro.
Espectrofotômetro, fotômetro e colorímetro
O espectrofotômetro permite escolher o comprimento de onda de cada análise em uma faixa ampla do espectro. O fotômetro e o colorímetro trabalham com comprimentos de onda fixos e são voltados para análises de rotina com parâmetros definidos. Entenda a diferença entre colorímetro e fotômetro.
Perguntas frequentes
Para que serve o espectrofotômetro?
Para medir a absorção de luz por uma amostra e, com isso, determinar a concentração e a pureza de substâncias como DNA, proteínas, enzimas e compostos químicos.
Como funciona o espectrofotômetro?
A luz da lâmpada passa pelo monocromador, que seleciona o comprimento de onda. Ela atravessa a amostra, e o detector mede quanto foi absorvido. A concentração é calculada pela Lei de Beer-Lambert.
Qual cubeta usar para leituras no ultravioleta?
Quartzo. O vidro e o plástico comum absorvem a radiação UV e distorcem a leitura.
O que significa a relação A260/A280?
Indica a pureza de ácidos nucleicos. Valores próximos de 1,8 para DNA e 2,0 para RNA indicam amostras sem contaminação significativa por proteínas.
Qual a diferença entre espectrofotômetro de feixe único e de feixe duplo?
O feixe único mede referência e amostra em sequência. O feixe duplo mede as duas ao mesmo tempo, compensando variações da lâmpada e garantindo mais estabilidade.
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Referências
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (Brasil). Farmacopeia Brasileira. 6. ed. Brasília: ANVISA, 2019. Métodos físicos e físico-químicos: espectrofotometria de absorção no ultravioleta e no visível.
HARRIS, D. C. Análise Química Quantitativa. 9. ed. Rio de Janeiro: LTC, 2017.
SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Princípios de Análise Instrumental. 6. ed. Porto Alegre: Bookman, 2009.
SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de Química Analítica. 9. ed. São Paulo: Cengage Learning, 2015.
