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Apesar do recente desenvolvimento técnico dos laboratórios científicos, a câmara de Neubauer continua sendo o método mais utilizado para contagem de células em todo o mundo. Este texto do blog foi elaborado para ajudar pesquisadores experientes, assim como não experientes, a realizar uma contagem adequada de células usando uma câmara de Neubauer ou hemocitômetro. Os princípios descritos nesse post  de dados técnicos aplicam-se a qualquer câmara de contagem de células, embora as dimensões e os volumes de cada câmara possam ser diferentes. Nesse post descrevemos  as melhores práticas, aplicativos e recomendações ao realizar uma contagem de células.

Os materiais necessários para realizar uma contagem de células com a câmara de Neubauer são os seguintes:

  1. Frasco de cultura celular
  2. Hemocitômetro ou câmara de Neubauer
  3. Microscópio óptico
  4. Lâminula de vidro
  5. Pipeta / Micropipeta com ponteiras  descartáveis
  6. Tampão de diluição / PBS (se necessário)

A grade de contagem da câmara de Neubauer tem 3 mm x 3 mm de tamanho. A grade tem 9 subdivisões quadradas de 1 mm de largura  No caso de contagem de glóbulos, os quadrados colocados nos cantos são usados ​​para contagem de glóbulos brancos. Como sua concentração é menor que a de hemácias, uma área maior é necessária para realizar a contagem de células. O quadrado central é usado para plaquetas e glóbulos vermelhos. Este quadrado é dividido em 25 quadrados de largura de 0,2 mm (200 µm). Cada um dos 25 quadrados centrais é subdividido em 16 pequenos quadrados.  Portanto, o quadrado central é feito de 400 pequenos quadrados.

Lâmina de vidro

A lâmina de vidro é um vidro quadrado de 22 mm de largura. A lâmina  de vidro é colocada no topo da câmara de Neubauer, cobrindo a área central. A lâmina de vidro  deixa espaço para a concentração de células entre o fundo da câmara e a própria tampa. A câmara é projetada de forma que a distância entre o fundo da câmara e a lâmina  seja de 0,1 mm. Não é incomum que a lâmina  de vidro permaneça ligeiramente levantada quando introduzimos mais líquido do que o necessário na câmara. Para evitar isso, algumas câmaras de contagem têm dois grampos especiais para evitar  faça o levantamento das bordas. Se a lãmina de vidro  for levantada, a distância entre a câmara e a tampa será superior a 0,1 mm e as contagens de células não serão precisas.

Micropipeta

A micropipeta permite a introdução de uma quantidade precisa de líquido na câmara de Neubauer. Historicamente, as pipetas  eram  fabricados em vidro. Hoje em dia, as pipetas de vidro foram substituídas por micropipetas, que podem ser calibradas com capacidades máximas de 20.200 e 2.000 µl.

Etapa 1 – Preparação da amostra

Dependendo do tipo de amostra, deve-se preparar uma diluição com uma concentração adequada para a contagem de células.
Normalmente, o intervalo de concentração para uma contagem de células com câmara de Neubauer é entre 250,1 células / ml e 2,5 milhões de células / ml.
Recomenda-se que a concentração de diluição seja em torno de 106 células / ml (1 milhão de células / ml) aplicando as diluições necessárias. Com concentrações abaixo de 250.000 células por ml, (2,5 x 105 células / ml) a quantidade de células contadas não será suficiente para obter uma estimativa justa da concentração original.
Acima de 2,5 milhões de células / ml (2,5 x 10 6 ), a probabilidade de erros de contagem aumenta, bem como o tempo e o esforço necessários para atingir uma contagem confiável de células.
Acima de 2,5 milhões, é preferível diluir a amostra para obter uma concentração final mais próxima do ótimo 1 milhão por ml. É importante anotar a diluição realizada na amostra original.

Etapa 2 – Introdução da amostra na câmara de Neubauer

Pegue 10 µl da diluição preparada no passo 1 com a micropipeta.

  1. Coloque a lâmina de vidro na área central da câmara de Neubauer. Use uma superfície plana para colocar a câmara, como uma mesa ou bancada.
  2. Coloque uma ponteira  descartável no final da micropipeta.
  3. Ajuste a micropipeta para extrair 10 µl. Você pode ajustá-lo girando a roleta do êmbolo superior para selecionar o volume de pipetagem necessário.
  4. Introduza a ponteira  da micropipeta na diluição previamente preparada na etapa 1.
  5. Empurre o êmbolo da micro pipeta lentamente até sentir que chegou ao fim do curso.
  6. Retire a ponteira da pipeta da diluição e leve-a para a câmara de Neubauer. Quando a micropipeta é carregada, ela deve ser sempre mantida na posição vertical
  7. Coloque a ponteira  da micropipeta perto da borda da tampa de vidro, bem no centro da câmara de Neubauer.
  8. Solte o êmbolo lentamente, observando como o líquido entra uniformemente na câmara, sendo absorvido por capilaridade.
  9. Em caso de aparecimento de bolhas ou de movimentação da lãmina  de vidro, repita a operação.

A câmara de Neubauer foi carregada e está pronta para realizar a contagem de células!

Configuração e foco do microscópio

  1. Coloque a câmara de Neubauer na platina do microscópio óptico . Se o microscópio tiver uma pinça de fixação, fixe a câmara de Neubauer.
  2. Ligue a luz do microscópio.
  3. Foque o microscópio até que você possa ver uma imagem nítida das células olhando através da ocular e ajustando o palco.
  4. Procure o primeiro quadrado de grade de contagem onde a contagem de células começará. Neste momento  quadrados grandes de uma câmara aprimorada por Neubauer serão contados.
  5. Comece a contar as células do primeiro quadrado. Laboratórios diferentes têm protocolos de contagem diferentes, no entanto, existe uma regra não escrita popular que afirma: “As células que tocam os limites superior e esquerdo devem ser contadas, ao contrário das células que tocam os limites inferior e direito, que não devem ser levados em consideração.”
Em caso de alta concentração de células, será muito fácil se perder ao contar as células. Nesse caso, é utilizada uma técnica de contagem em zigue-zague.
  1. Anote a quantidade de células contadas no primeiro quadrado.
  2. Repita o processo para os quadrados restantes, anotando os resultados da contagem de todos eles. Quanto maior for o número de células contadas, maior será a precisão da medição.

Etapa 4 – cálculo de concentração

Aplicamos a fórmula para o cálculo da concentração:

Concentração (células / ml) = Número de células / Volume (em ml)

O número de células será a soma de todas as células contadas em todos os quadrados contados.

Como o volume de 1 grande quadrado é:

0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm 2 de área contada.

Uma vez que a profundidade da câmara é de 0,1 mm:

0,1 mm = 0,01 cm

0,01 cm 2 x 0,01 cm = 0,0001 cm 2 = 0,0001ml = 0,1 µl

Assim, para a câmara de Neubauer, a fórmula utilizada na contagem dos grandes quadrados é:

Concentração = Número de células x 10.000 / Número de quadrados

No caso de ser aplicada uma diluição, a concentração obtida deve ser convertida para a concentração original antes da diluição.

Nesse caso, a concentração deve ser dividida pela diluição aplicada. A fórmula será:

Concentração = Número de células x 10.000 / Número de quadrados x diluição

Exemplo:

Para uma diluição de 1:10 → Diluição = 0,1
Para uma diluição de 1: 100 → Diluição = 0,01

Erros

Erros na faixa de 20-30% são comuns neste método devido a erros de pipetagem, erros estatísticos, erros de volume da câmara e erros do volume da amostra introduzida na câmara. Apesar disso, a câmara de Neubauer continua sendo o método de contagem de células mais usado no mundo.

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