PCR Clean-up OneStep
PCR Clean-up OneStep é um procedimento utilizado para purificar e concentrar produtos de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) antes de serem utilizados em aplicações subsequentes, como sequenciamento de DNA. Esse método remove primers, nucleotídeos não incorporados, enzimas e sais, que podem interferir no sequenciamento. O objetivo é otimizar os resultados do sequenciamento, eliminando contaminantes que possam prejudicar a qualidade e a precisão das leituras. O PCR Clean-up OneStep é uma etapa importante para preparar as amostras de DNA para sequenciamento, garantindo que estejam livres de impurezas que possam afetar a análise genética subsequente.
- PCR Clean-up OneStep otimiza seus resultados de sequenciamento. Clean-up fornece resultados em 5 minutos.
- O PCR CleanUp PureIT ExoZAP consiste em uma combinação equilibrada entre Exonuclease termolábil I (HL-ExoI) e fosfatase alcalina de camarão recombinante (rSAP).
- O tratamento dos produtos da reação de PCR com o PCR CleanUp PureIT ExoZAP remove primers residuais, DNAs de fita única e inativa o excesso de dNTPs por defosforilação. Adicione o PCR CleanUp PureIT ExoZAP diretamente à reação contendo o produto amplificado da PCR.
- Após o tratamento a 37 °C por, no mínimo, 2 minutos, a PCR CleanUp PureIT ExoZAP se torna completamente inativada por aquecimento a 80 °C pelo menos por 3 minutos.
Características:
- PCR Clean-up OneStep protocolo rápido de 5 minutos.
- Não necessita de colunas Spin ou contas magnéticas.
- Tratamento melhora aplicações downstream, como sequenciamento de DNA e análise de SNPs.
- Ideal para a preparação de protocolos em construção de bibliotecas em sequeciamento de última geração (NGS).
Protocolo (Este protocolo funciona como guideline para o clean-up de 5 μl de produtos da PCR utilizando-se a PCR CleanUp PureIT ExoZAP):
- Remova a PCR CleanUp PureIT ExoZAP do freezer a -20°C.
- Mantenha a PCR CleanUp PureIT ExoZAP sobre o gelo por todo o tempo.
- Agite bem e gradualmente suspenda a agitação.
- Incube a reação a 37 °C de 2 a 5 minutos para degradar os primers remanescentes e DNA de fita única e a fim de inativar nucleotídeos em excesso por defosforilação.
- Incube a 80°C de modo a inativar completamente a PCR CleanUp PureIT ExoZAP de 3 a 10 minutos.
- Os produtos purificados da PCR agora podem ser utilizados para aplicações seguintes, como sequenciamento de DNA, extensão de primers ou análise de SNP.
- Após o tratamento, os produtos da PCR podem ser armazenados a -20°C.
OBS: Se o tratamento do produto da PCR produzir um volume mais elevado, aumente proporcionalmente a quantidade de PCR CleanUp PureIT ExoZAP.
- O produto de PCR de 866 pb foi amplificado usando TEMPase DNA Polimerase em Ammonium Buffer. O produto de PCR foi enriquecido com dNTPs e primers e depois tratado (A) sem PureIT ExoZAP PCR CleanUp (B) com PureIT ExoZAP PCR CleanUp (2 +3 min) e (C) com um reagente de limpeza de PCR enzimático de uma marca concorrente (1+ 4 min) antes da sequenciação de Sanger. Todas as amostras foram analisadas em triplicata e de acordo com as recomendações dos fabricantes.
- O resultado do sequenciamento de Sanger foi comparado plotando graficamente o número de chamadas de base com certos valores de qualidade (pontuação de Phred).
- O tratamento de produtos de PCR com PureIT ExoZAP melhora significativamente a qualidade do sequenciamento de DNA.
- Além disso, PureIT ExoZAP PCR CleanUp mostrou resultados de limpeza de PCR equivalentes ao reagente de limpeza de PCR concorrente.
- OBS: Dados com valores de qualidade inferiores a 10 não são incluídos.
- Resultados da sequenciação de Sanger do produto de PCR de 866 pb. Os eletroferogramas representados são após o tratamento com PureIT ExoZAP PCR CleanUp (superior) ou não tratados (inferior). A sequência mostrada é aproximadamente a região de 250 a 300 bases.
- O tratamento do produto PCR enriquecido com PureIT ExoZAP PCR CleanUp melhora significativamente a qualidade do Sequenciamento Sanger.
- O tratamento aumenta a intensidade do sinal e elimina a interferência de fundo e erros de base.
