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Hoje em nosso post vamos falar sobre a técnica de PCR. Vamos dividir o PCR em etapas para ficar mais fácil a explanação. O diagnóstico etiológico da SARS-COV-2 é atualmente realizado pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detecção de RNA viral na amostra; ensaio imunoenzimático (ELIZA) para detecção da presença de anticorpos no soro (testes rápidos para detecção de anticorpos ou antígenos)  e tomografia computadorizada.  A técnica de PCR apresenta melhor acurácia quando realizada entre 2 e 5 dias após o início dos sintomas, com coleta de material por swab oral / nasal ou escarro ; os testes sorológicos podem ser coletados a partir do sétimo dia.

PCR é A técnica dos modernos laboratórios de biologia molecular. Se você precisa copiar, sequenciar ou quantificar DNA, você precisa saber PCR. Resumindo, PCR (reação em cadeia da polimerase) é uma técnica bioquímica que usa termociclagem e enzimas para copiar DNA de forma rápida e confiável, e foi inventada em um flash de inspiração por um cientista dirigindo na Rodovia 128 de São Francisco a Mendocino.

Este artigo do blog oferece uma visão geral breve e básica do PCR, com algumas dicas para ajudá-lo a evitar as armadilhas mais comuns. Se você é novo ou relativamente novo no PCR, isso é para você. (E mesmo se você tiver experiência em PCR, vale a pena ler para atualizar e talvez pegar uma ou duas dicas!).

Etapa 1:  COLETA

Uma amostra de DNA ou RNA a ser testada é coletada usando swab de rayon , agulhas, pinças descartáveis ​​ou outras ferramentas. A amostra pode ser de saliva, sangue, cabelo, osso antigo, raspagem de pele, planta, solo, etc. Ela é colocada em um tubo ou recipiente. Um reagente de estabilização é adicionado para preservar a amostra. Se a amostra ainda não estiver em um centro de pesquisa, ela será transportada com segurança para que possa ser preparada para o processo de PCR e testada.

Produtos para laboratório necessários para  PCR

Tubo para coleta de Amostra

Swab de Rayon,

 

Produtos de Segurança Pessoal como luvas, avental, óculos…

Etapa 2 : PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

A amostra é extraída de seu recipiente e o ácido nucleico é purificado por meio de um método de lise, extração orgânica e / ou extração / purificação em coluna. Uma vez que a amostra é purificada e extraída, um Mastermix é adicionado. Este contém primers de DNA, DNA polimerase (enzima) e uma mistura de solução de nucleotídeos. Esta solução agora está pronta para o processo de PCR.

Equipamentos de Laboratório necesários para etapa 2 do PCR

Micropipeta

Agitador de tubo

Centrífuga para laboratório

Cabine de Pcr

  • A Cabine Asséptica para PCR/DNA, também conhecida como DNA Workstation, é utilizada na manipulação de processos que necessitem ambiente asséptico e com controle bacteriológico.
  • A Cabine Asséptica para PCR/DNA é Fabricada em aço carbono com tratamento anti-ferrugem e pintura eletrostática a pó, e possui portas e visores em plástico tipo acrílico transparente, com o sistema de abertura vertical no ângulo de 180 graus, que permite ao usuário mover a porta inferior para cima e para baixo, proporcionando uma área maior, melhor e mais flexível para o preparo de suas amostras.
  • O material de fabricação da Cabine Asséptica para PCR/DNA apresenta resistência química à quase todos os produtos sanitizantes.
  • A Cabine Asséptica para PCR/DNA possui duas lâmpadas: uma ultravioleta germicida e outra fluorescente branca para observação dos testes realizados pelo operador.
    Utilizada em Laboratórios em geral, Farmácias de Manipulação, Indústrias e Qualquer atividade que exija ambiente asséptico.
  • A iluminação por UV da Cabine Asséptica para PCR/DNA emite radiação de 250 nm à 350 nm, que entram em contato com o DNA e RNA da bactéria e reagem fotoquímicamente, cessando a reprodução do mesmo, tornando o ambiente totalmente asséptico.

Etapa 3: AMPLIFICAÇÃO -PCR convencional ou PCR tempo real.

A solução é colocada em um termociclador (PCR ou qPCR) para iniciar o processo de replicação / amplificação. Esta amostra inicial de DNA / RNA é replicada em milhões de segmentos duplicados de DNA / RNA. O processo de PCR envolve três etapas:

• Desnaturação: A solução contida no tubo  é aquecida a pelo menos 94 ° C (201,2 ° F) usando um termociclador em tempo real . O calor quebra as ligações de hidrogênio da amostra de DNA original e separa o DNA em fitas simples.

• Recozimento: A mistura da amostra é então resfriada entre 50-60 ° C (122-140 ° F) permitindo que os primers de DNA e a enzima DNA polimerase se liguem às fitas individuais de DNA que foram separadas pelo calor.

• Extensão: Os nucleotídeos (A, T, C, G) da solução de mistura adicionada irão emparelhar com as fitas individuais separadas de DNA que resultaram do processo de aquecimento. Uma vez unidos, eles formam uma nova fita complementar de DNA.

Este processo fornece uma nova molécula de DNA de fita dupla duplicada formada a partir de cada uma das fitas simples da molécula da amostra original. Este processo de três etapas é realizado de 35 a 40 vezes para amplificar o DNA / RNA em milhões de segmentos duplicados.

 
 
Etapa 4 : ANÁLISE

Os segmentos amplificados de DNA / RNA do processo de PCR estão prontos para análise. O método mais popular usado para fazer isso é chamado de eletroforese em gel. Na eletroforese, basicamente as amostras de DNA / RNA são carregadas em uma extremidade de um gel e colocadas em um sistema de eletroforese onde uma corrente elétrica é passada através do gel. Os segmentos de DNA / RNA são separados em bandas semelhantes a um padrão de escada, de acordo com sua carga elétrica e tamanho. Uma vez que o gel é corado e visualizado sob luz ultravioleta, os segmentos de DNA / RNA processados ​​por PCR são comparados com uma fonte de controle conhecida.

 

Os segmentos de DNA amplificados do processo de PCR estão prontos para análise. O método mais popular usado para fazer isso é chamado de eletroforese em gel. Na eletroforese em gel, os segmentos de DNA são carregados em poços dentro de um gel colocado em um sistema de eletroforese. Para comparação, outros segmentos de DNA de tamanho conhecido são incluídos. Uma corrente elétrica é passada pelo gel, separando os segmentos de DNA de acordo com seu tamanho. Isso resulta em um padrão de faixas semelhante a uma escada. O posicionamento dos segmentos de DNA amplificados em relação aos marcadores conhecidos revela a identidade da amostra do processo de PCR.

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