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Como fazer o  Teste de tetrazólio em sementes de soja?

A produção e a utilização de sementes de alta qualidade são fatores básicos da maior importância para o sucesso da cultura da soja.
Para que tais requisitos sejam alcançados, o sistema de controle de qualidade na indústria de sementes deve ser ágil, versátil e confiável, fornecendo resultados precisos e de maneira rápida.

Algumas determinações, como pureza física e varietal, grau de umidade e índice de danos mecânicos podem ser realizadas em apenas alguns minutos, suprindo, parcialmente, tais exigências.
A demora na obtenção dos resultados de germinação resulta numa séria
limitação ao processo de tomada de decisões na indústria de sementes. Além da demora em sua execução, este teste, na sua forma de avaliação tradicional, não fornece informações quanto ao vigor, não permite de maneira precisa a identificação dos fatores que afetam a qualidade das sementes, e seus resultados são freqüentemente mascarados pela ocorrência de danos de embebição
Tais limitações podem resultar em sérios prejuízos aos produtores de
sementes por afetar negativamente a tomada de decisões relativas à colheita, ao processamento, à armazenagem e à comercialização.

Princípio do Teste de tetrazólio

O teste de tetrazólio baseia-se na atividade das enzimas desidrogenases
as quais catalizam as reações respiratórias nas mitocôndrias, durante a glicólise e o ciclo de Krebs. Estas enzimas, particularmente a desidrogenase do ácido málico, reduzem o sal de tetrazólio (2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio ou TCT) nos tecidos vivos. Quando a semente de soja é imersa na solução incolor de TCT, esta é difundida através dos tecidos, ocorrendo nas células vivas a reação de redução que resulta na formação de um composto vermelho, estável e não-difusível, conhecido por trifenilformazan:

Como fazer o  Teste de tetrazólio em sementes de soja?

Quando o Tetrazólio  é reduzido, formando o trifenilformazan, isto indica que há atividade respiratória nas mitocôndrias, significando que há viabilidade celular e do tecido. Portanto, a coloração resultante da reação é uma indicação positiva da viabilidade através da detecção da respiração a nível celular. Tecidos não viáveis não reagem e conseqüentemente não são coloridos.
Sendo o tecido vigoroso, haverá a formação de um vermelho carmin
claro; se o tecido está em deterioração, um vermelho mais intenso será formado, em virtude da maior intensidade de difusão da solução de TCT pelas membranas celulares comprometidas de tais tecidos; se o mesmo é não viável, a redução do sal não ocorrerá, e o tecido morto contrastará como branco (não colorido) com o tecido colorido viável. A observação de tais diferenças de cor, juntamente com o conhecimento de diversas características das sementes, permitem a determinação da presença, da localização e da natureza dos distúbios que podem ocorrer nos tecidos embrionários

Para a realização do teste de tetrazólio  é necessário o seguinte:

Como fazer o  Teste de tetrazólio em sementes de soja?

Câmara de Germinação de Plantas e Sementes com Fotoperído e Alternância de Temperatura

Câmara de Germinação ou Câmara Germinadora é um equipamento indispensável nos laboratórios de sementes, plantas, laboratórios de entomologia entre outros. Este equipamento proporciona um ambiente que simula a luz do dia quanto a luz da noite propiciando um ambiente perfeito para a germinação das sementes .

não utilizar frascos metálicos, para evitar redução da solução de tetrazólio em trifenilformazan,

Preparo da Solução de Tetrazólio

Recomenda-se utilizar solução na concentração de 0,075%, pois a mesma
permite uma coloração adequada das sementes, permitindo a visualização com maior precisão de danos mecânicos recentes, causados por abrasão, que normalmente não seriam detectados com o uso de soluções mais concentradas (0,5 a 1,0%), conforme sugerido na literatura internacional Além disso, a utilização de solução nessa concentração é mais econômica: com um vidro de 10 g de TCT pode-se testar a viabilidade de até 200 lotes de semente, utilizando a solução a 0,075%. Caso a solução utilizada tivesse a concentração de 1,0%, apenas 15 amostras poderiam ser avaliadas com 10 g do sal.
Prepara-se, inicialmente, a solução estoque a 1,0%, misturando 10,0 g do sal de tetrazólio em 1,0 litro de água destilada. Esta solução deve ser armazenada em frasco de vidro de cor âmbar, em local escuro e fresco, de
preferência na geladeira. Quando necessário, prepara-se a solução de trabalho a 0,075%, que também deve ser armazenada com os mesmos cuidados da solução estoque: 1,0 litro de solução a 0,075% = 75 ml solução estoque (1,0%) + 925 ml de H2O.
A água utilizada no preparo da solução de trabalho pode ser destilada ou
da rede de abastecimento, desde que apresente o pH entre 6 e 7, e não seja
salobra.

Preparo das Sementes

A amostra de trabalho deve ser representativa do lote e coletada conforme
prescrito pelas Regras para Análise de Sementes (RAS; Brasil, 1992).

Número de Sementes
Para o teste de germinação (em areia ou rolo de papel) as RAS recomendam a utilização de 400 sementes por amostra, (8 sub-amostras com 50 sementes
cada). Para o teste de tetrazólio é sugerida a utilização de 100 sementes (2 subamostras com 50 sementes cada), conforme sugerido pela AOSA (1983), Moore (1973), França Neto (1981) e França Neto et al. (1985; 1988).
A necessidade de um menor número de sementes para o teste de tetrazólio
é devida às condições homogêneas a que são submetidas todas as sementes
durante o seu preparo, o que, normalmente, não ocorre durante a execução do teste padrão de germinação. Os resultados desse último teste podem ser afetados por diversos fatores: gradientes de umidade e temperatura comumente encontrados nos germinadores; diferenças do pH e da textura do papel; variação na quantidade de água adicionada ao substrato; e a presença de fungos, como Phomopsis spp. e Fusarium semitectum nas sementes testadas.

Pré-condicionamento

As sementes devem ser embaladas em papel de germinação umedecido
e mantidas nestas condições por um período de 16 horas, na temperatura de 25ºC. Para evitar a perda de umidade, as embalagens devem permanecer em câmara úmida, ou seja, em saco plástico, em germinador ou em dessecador com água em lugar de sílica-gel.
Os tegumentos de sementes escuras de soja normalmente não permitem
a difusão da solução de tetrazólio. Portanto, os mesmos devem ser removidos das sementes antes do processo de coloração.
Caso haja a necessidade de maior rapidez, pode-se utilizar a metodologia
alternativa, sugerida por Costa et al. (1998), realizando-se o pré-condicionamento por 6 horas a uma temperatura de 41ºC, o que representa um ganho de 10 horas no preparo das sementes, sem que haja perda de precisão dos resultados.

Coloração:

Após o pré-condicionamento, as sementes são colocadas em frascos
becker  sendo totalmente submersas na solução de tetrazólio (0,075%). As sementes devem permanecer assim a uma temperatura de 35ºC a 40ºC por aproximadamente 150 a 180 minutos. Esta temperatura pode ser obtida utilizando-se uma estufa incubadora
É bom ressaltar que esta operação deve ser realizada no escuro, uma vez
que a solução de tetrazólio é sensível à luz

Lavagem da Amostra:

Alcançada a coloração ideal, as sementes são retiradas do ambiente a
35ºC – 40o C e são, em seguida, lavadas com água comum e devem ser mantidas submersas em água até o momento a avaliação. Caso as amostras não sejam avaliadas de imediato, devem ser mantidas em refrigerador, por até 12 horas.

Conclusão:

Apesar de não utilizar equipamentos e reagentes caros, o teste requer
que o analista de sementes seja bem treinado nas técnicas do teste. É básico o conhecimento das estruturas anatômicas da semente pelo analista. Experiência, imaginação e julgamento crítico são também necessários para que o analista possa visualizar os tipos de anormalidades de plântulas que são revelados pelo teste de tetrazólio. A precisão do teste depende do conhecimento de todas as técnicas e procedimentos envolvidos.

O teste de tretrazólio  pode ser aplicado em todas as etapas do sistema de produção de sementes, visando aprimorar o controle de qualidade, ou seja, na colheita, na recepção, antes e após o beneficiamento e a secagem, durante o armazenamento e antes da semeadura.
Ele tem sido utilizado com sucesso mesmo antes da colheita: cerca de
um ou dois dias antes da colheita, faz-se uma amostragem de plantas de um
determinado campo de produção, trilhando-se as sementes manualmente.
Através da avaliação dessas sementes pelo teste de tetrazólio, pode-se verificar os níveis de vigor, viabilidade e da ocorrência de danos de percevejo e de deterioração por umidade.

Dependendo dos resultados obtidos, poderá ser decidido com segurança se o referido campo apresenta qualidade para ser colhido como semente ou como grão. Isto pode resultar em economias significativas aos produtores de sementes, no que se refere a evitar despesas desnecessárias
de transporte, secagem, beneficiamento, embalagem e armazenamento de lotes de sementes de baixa qualidade

Fonte: Embrapa

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