Brazol (Reagente a base de fenol para extração de ácidos nucléicos e proteínas) – NOVA BIOTECNOLOGIA

• O BRAZOL é um reagente utilizado no isolamento de ácidos nucleicos, DNA, RNA e proteínas a partir de amostras de células e tecidos.
• O BRAZOL é a versão otimizada do popular método passo-único de isolamento total de RNA, baseado na metodologia desenvolvida por Chomczynski & Sachi (1, 2, 3).
• Esta metodologia de extração tem se mostrado altamente eficaz na purificação de ácidos nucléicos a partir de materiais biológicos, tais como: soro, plasma, sangue total coletado ou não com EDTA, células obtidas a partir de cultivos e/ou tecidos congelados. O protocolo a seguir foi padronizado para aplicação em protocolos de amplificação e outras técnicas comuns em laboratórios de Biologia Molecular. Esta técnica é confiável e possui bom desempenho para diferentes quantidades de amostras.
• O BRAZOL combina as propriedades do fenol e do tiocianato de guanidina, que inibem imediata e efetivamente a atividade da enzima RNAse. As células presentes na amostra biológica são lisadas através deste reagente e, após homogeneização e adição de clorofórmio e posterior centrifugação, o produto resultante é separado em duas fases visíveis: aquosa e orgânica, respectivamente.
• O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa, o DNA pode ser encontrado na interfase entre a fase orgânica e a fase aquosa e as proteínas exclusivamente na fase orgânica (azul). O RNA pode ser precipitado através da adição de isopropanol gelado seguido de lavagens com etanol 70% e dissolvido em água ou tampão TE. O DNA e as proteínas podem ser precipitados através da adição de etanol e isopropanol, seguido de lavagem com etano.

Precauções especiais de manuseio:

• O BRAZOL contém fenol (tóxico) e isotiocianato de guanidina (cáustico) que podem provocar queimaduras e, se ingerido, pode ser fatal. Ao empregá-lo em rotinas laboratoriais utilize sempre luvas, avental e protetor para os olhos. Evite o contato com a pele ou com a roupa e não inale seu vapor.
• Leia as notas de advertência contidas no frasco que acondiciona o produto.
• Em caso de contato acidental: enxágue imediatamente a região atingida com abundante água, por pelo menos 15 minutos e procure imediatamente orientação médica.

Reagentes necessários, não fornecidos:

• Clorofórmio; pode ser substituído por 1-bromo-3-cloropropano (5).
• Isopropanol.
• Etano.

Isolamento de Ácidos Nucléicos:

• Esta metodologia é eficaz para o isolamento de RNA de diferentes espécies e amostras, raramente observada através de outros métodos (4). Utilizando-se o BRAZOL para extração de RNA, o tempo de ensaio é em torno de uma hora. O protocolo prevê basicamente a extração de RNA total a partir de 100 µL de volume de amostra podendo ser realizado em tubos de 500 µL.
• Para volumes maiores, ou outro tipo de amostras, deve-se manter a proporção entre os diferentes reagentes bem como a utilização de tubos com capacidade maior. Aconselha-se realizar todo o procedimento em ambiente controlado (15°C a 30°C), observando sempre a utilização de ponteiras e tubos RNAse free, bem como os reagentes adicionais, acima indicados em baixa temperatura.

Protocolo de Extração:

1) Homogeneização:

• Tecidos: 1 mL de Brazol para cada 50-100 mg de tecido, mecanicamente homogeneizado. O volume da amostra não deve exceder 10% do volume de Brazol usado para homogeneização.
• Células de crescimento em monocamadas: Lisar as células coletadas diretamente da placa de cultura adicionando 1 mL de Brazol para cada 3,5 cm de diâmetro da placa e passando o lisado de células várias vezes pela pipeta. A quantidade de Brazol adicionada é baseada na área da placa de cultura (aproximadamente 1 ml para 10 cm2 e não no número de células presentes. Uma quantidade insuficiente de Brazol poderá resultar na contaminação do RNA isolado, com DNA.
• Células de crescimento em suspensão: Centrifugar as células até formar um pellet. Lisar as células com Brazol através de repetidas pipetagens up and down. Utilizar 1 mL do reagente para cada 5 – 10×106 de células animais, de plantas ou de leveduras, ou para 1×107 células bacterianas. A lavagem excessiva das células antes da adição de Brazol deve ser evitada porque aumenta a possibilidade de degradação do mRNA.
• Sangue total: Adicionar 1 mL de BRAZOL para cada 300 µL de amostra.2 – Agitar os tubos por inversão ou com auxílio de agitador, tipo vôrtex, por 2 minutos e adicionar 250 µL de clorofórmio gelado. Agitar novamente;

2) Agitar os tubos por inversão ou com auxílio de agitador, tipo vôrtex, por 2 minutos e adicionar 250 µL de clorofórmio gelado. Agitar novamente;
3) Centrifugar as amostras a 12.000 x g (aproximadamente 10.000 rpm) a 4°C, por 20 minutos;
4) Transferir o sobrenadante para novos tubos contendo 500 µL de isopropanol gelado no processo de extração de RNA ou 500 µL de etanol absoluto gelado para o DNA;
5) Agitar os tubos por inversão durante 2 minutos;
6) Centrifugar a 12.000 x g a 4°C, durante 15 minutos;
7) Desprezar o sobrenadante por aspiração ou cuidadosa decantação, observando para não eliminar o pellet;
8) Lavar o pellet com 500 µL de etanol 70%, homogeneizar por inversão e centrifugar a 12.000 x g a 4°C, durante 10 minutos;
9) Desprezar o sobrenadante como na etapa 7, cuidando para não aspirar o pellet;
10) Dissolver o pellet em água estéril ou em tampão TE 1X estéril;
11) Quantificar a concentração final dos ácidos nucléicos obtidos através de leitura em espectrofotômetro ou estimando a concentração em géis de agarose, para o RNA trabalhar em condições desnaturastes;

• As amostras assim processadas estão prontas para serem utilizadas em reações de amplificação e demais aplicações da Biologia Molecular;

Armazenamento:

• Armazenamento: 2°C e 8°C.