Agarose para Biologia Molecular LE – NOVA BIOTECNOLOGIA

• A agarose (Low Electroendosmosis) é um hidro coloide de galactano linear purificado isolado a partir de algas marinhas ágar-ágar ou ágar.
• Estruturalmente, é um polímero linear que consiste em unidades alternadas de D-galactose e 3,6-anidro-L-galactose.
• Este polímero purificado é utilizado na separação por eletroforese de fragmentos de ácidos nucléicos com elevado desempenho entre 150 a 23.000 pb.

Como agente gelificante, utiliza-se agarose:

1. Para separar os ácidos nucleicos por eletroforese, porque os seus géis formam poros de tamanhos maiores do que os géis de poliacrilamida. Ao contrário da poliacrilamida, a consistência do gel é mais sólida (mas também menos elástico);
2. Demonstrar reação cruzada no IEP (Immunoeletroforese) e placas de Ouchterlony (dupla difusão) nas quais as linhas de precipitina anticorpo-antígeno são estudadas com fins de diagnóstico.
3. Para fazer placas de gel ou sobreposições para células em cultura de tecidos.
4. Para formar uma matriz de gel (ou frisada e/ou reticulado) que pode ser usado em separações cromatográficas.

Propriedades da agarose:

• Grupos aniônicos em gel de agarose são fixados à matriz e não podem se mover, mas os cátions dissociáveis podem migrar em direção ao catodo na unidade de eletroforese, dando origem à electroendosmosis (EEO) – movimento do líquido através do gel. Como o movimento eletroforética de bipolímeros é geralmente direcionado ânodo, o EEO pode interromper as separações devido à convecção interna.

Especificações analíticas:

• O teor de sulfato pode ser usado como um indicador de pureza, uma vez que o sulfato é o principal grupo iônico presente.
• A força do gel é a força que deve ser aplicada a um gel para causar fraturas.
• O ponto de gel é a temperatura à qual uma solução aquosa de agarose forma um gel à medida que esfria.
• Agarose soluções exibem histerese na transição líquido-gel – isto é, o ponto de gel não é o mesmo que temperatura de fusão.
• pH em solução: 6,59.
• pH em gel: 6,30.
• Temperatura de polimerização 36,9°C +/- 1,5 °C.
• Temperatura de fusão (Melting Temperature) 87,4°C. Sensibilidade (gel 1,0%): ≥2.500 g/cm².
• Sulfatos: ≤ 0,15% e Livre de DNAse/RNAse/proteases/endonucleases.

Aplicações:

• Indicado na separação de fragmentos acima de 1.000 pb.
• Manipulação enzimática direta de DNA,
• Separação e recuperação de fragmentos de DNA de tamanhos grandes.

Instruções de preparação do gel de agarose em forno de micro-ondas:

1. Utilizar um béquer de 2 a 4 vezes maior em volume do que a solução de agarose a ser preparada.
2. Pesar a quantidade de agarose em pó necessário para a preparação do gel de interesse.
3. Adicionar o tampão de eletroforese 1X ou 0.5X e misturar com auxílio de barra e agitador magnéticos dentro de um béquer.
4. Retirar a barra magnética, principalmente se essa não for de teflon.
5. É recomendável deixar a agarose no tampão por 5 minutos antes de colocar para aquecer. Este procedimento diminui a tendência da agarose de provocar pequenas explosões durante o aquecimento.
6. Cobrir o béquer com folha plástica (wrap plastic), cuidando para fazer alguns furos para ventilação e para não explodir quando em ebulição.
7. Ferver a agarose por aproximadamente um minuto e, retirar com muito cuidado da fonte de calor utilizando luvas de proteção.
8. Deixar esfriar a solução entre 45°C a 55°C antes de colocar no suporte de acrílico.
9. Esvaziar o conteúdo dentro de um suporte de plástico com o pente e deixar polimerizar.

Armazenamento:

• Entre 10°C e 30°C.